病毒介导的细胞病变效应

病毒感染宿主细胞后,通常会选择性抑制宿主细胞的相关功能,并利用其物质进行自我复制,最终导致细胞裂解死亡,病毒进一步扩散。宿主细胞在病毒感染早期,通常会发生形态学的变化,如细胞变圆、从细胞培养板脱离等,而此时,便可用RTCA技术对这些变化进行检测。RTCA检测方法独具的灵敏性,也使得其非常适合于各种病毒学的实验研究,包括:基于病毒复制特性的细胞病变效应特征,对病毒株进行区分;病毒滴度测定、中和抗体效价测定,病毒—宿主细胞相互作用而发生的形态学变化研究等。

应用案例1 :确定病毒滴度

传统的病毒滴定实验:空斑实验是一种既繁琐又费时的检测方法,而RTCA则独具优势。VERO细胞悬液加入梯度稀释的已知浓度的西尼罗河病毒(WNV),37℃静置反应30min,随后将细胞/病毒悬液加入到E-Plate培养板中。与处于融合平台期,未感染的对照细胞CI指数相比,病毒感染组细胞的CI值呈明显的时间梯度依赖性,随时间延迟,CI曲线一直呈下降的趋势,直至零,说明细胞已完全裂解(图1A)。重要的是,CPE产生的时间与病毒滴度呈现良好的相关性,可用CIT50(即CI值下降到50%所需要的时间)作为定量描述病毒滴度的参数(图1B)。通过标曲,即可确定未知浓度样品的病毒滴度。

图1. 西尼罗河病毒致细胞病变作用的实时监测。(A)时间-滴度依赖的西尼罗河病毒(WNV)致细胞病变效应。Vero细胞与梯度稀释的西尼罗河病毒孵育后,接种在E-Plate培养板中,xCelligence细胞分析系统实时监测200小时。图中水平线表示CIT50值(即细胞指数下降50%所需的时间)。(B)病毒致细胞病变效应的时间与病毒滴度的相关性。CIT50与已知浓度梯度的病毒滴度拟合的相关性曲线。此数据来源于J Virol Methods. 2011 May;173(2):251-8

应用案例2 :评估适应性和识别不同病毒株分离株

目前,研究者可以用ELISA、PCR、RT-PCR、Western blotting、空斑实验、免疫荧光等实验技术对病毒株进行鉴定和多方面的评估。由于病毒致细胞病变效应的动力学特异性,xCELLigence实时细胞分析系统(RTCA)可以用来代替或作为这些传统的方法的补偿,对病毒株进行评估和鉴定。下面例子中,研究者使用xCelligence RTCA技术监测了西尼罗河病毒(WNV)和圣路易斯脑炎病毒(Slev)相同感染复数下,Vero细胞的CPE效应曲线。如图2所示,这两种病毒感染后引起的CPE起始时间和细胞完全裂解死亡的时间都不尽相同。这种基于RTCA检测的动力学曲线即可用于评估不同病毒株的亲缘关系,或对病毒株进行鉴定。

图2. RTCA实时监控由西尼罗河病毒(WNV)和圣路易斯脑炎病毒(Slev)引起的细胞病变效应。用感染复数相同的WNV或Slev病毒感染Vero细胞,随后将细胞/病毒悬液加入到E-Plate培养板中。尽管WNV和Slev属于相同的种,但其CPE权限也显示出很大的差异:他们在不同时间引起细胞病变效应,并且从细胞完成完全裂解时间来看,Slev病毒比WNV病毒延迟了55小时。该数据来源于 J Virol Methods. 2011 May;173(2):251-8.

应用案例3 :确定中和抗体效价

除了用于治疗或预防目的外,中和抗体也可作为感染的诊断标志。测定样本中抗体是否存在或抗体浓度的一种方法即直接测定样本中和病毒感染的能力。 xCELLigence实时细胞分析系统因其极高的实验重复性、简便的实验步骤,使它非常适合于这种类型的实验。图3A,Vero细胞与固定量的西尼罗河病毒(WNV)共培养,该病毒是经含有已知浓度的病毒中和抗体的抗血清提前处理过的。不同样本之间细胞出现细胞病变效应的时间(即细胞指数降到零)存在显著差异。正如预期的那样,高稀释倍数下,抗血清的中和能力下降。绘制CIT50(即细胞指数下降50%所需的时间)和已知中和抗体效价关系的标准曲线(图3B)。该曲线可用于未知浓度样品中和抗体效价的测定。

图3. 中和抗体效价的定量测定。(A)Vero细胞与定量的西尼罗河病毒(WNV)培养,该病毒是经含有已知浓度的病毒中和抗体的抗血清提前处理过的,而阴性对照(未用病毒处理)则显示出稳定的细胞指数,阳性对照组(加入了未经抗血清处理的病毒)细胞病变效应(CPE)快速出现;抗血清处理则后,CPE被延迟。(B)抗血清/中和抗体滴度与CPE发生时间的相关性。绘制CIT50(即细胞指数下降50%所需的时间)和已知中和抗体效价关系的标准曲线。该数据来源于 J Virol Methods. 2011 May;173(2):251-8.

xCELLigence®在病毒介导的细胞病变应用的优势如下:

1、病毒滴度测定:自动、简洁、可替代空斑实验;

2 、评估病毒株:应用病毒介导的细胞病变效应动力学曲线可以非常容易的评估、确定病毒株(野生型/突变体);

3 、确认病毒的身份:通过病毒介导的细胞病变效应动力学曲线可以帮助我们确认病毒的身份;

4 、量化中和抗体效价:CPE和抗体浓度呈现相关性,可据此绘制出标准曲线,并用于未知浓度样品中和抗体的定量;

5、快速优化检测方法:快速测定病毒梯度,有效筛选抑制化合物、中和抗体和中和血清。